指示剂是如何负载细胞，目前有三种在神经元上填充钙离子指示剂的方法，且都可以用于体内和体外研究。第一种方法是利用玻璃吸管将膜渗透性盐或葡聚糖形式的指示剂注入单个神经元中。此方法方便实验者控制单个神经元内的钙离子指示剂浓度且信噪比较高。第二种是利用“批量加载”的方法将钙离子指示剂染料负载神经元，观察对象为一群神经元。尽管此方法可能导致一些胶质细胞也被指示剂所标记，但明显提高了整体神经元的标记百分比，使研究者得以观察到一群神经元内动作电位相关性的活动。第三种也较为常用，通过病毒转染的方式使其基因编码钙离子指示剂。（A）单细胞注射法；（B）networkloading法；（C）通过病毒转染使其基因编码钙离子指示剂（expressionofgeneticallyencodedcalciumindicators,GECI）双光子显微镜可精确穿透较厚标本进行定点、有生命体的观察！国内bruker双光子显微镜成像技术

配合双光子激发技术，激光共聚扫描显微镜则能更好得发挥功效。那么，什么是双光子激发技术呢？在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子使电子跃迁到较高能级，经过一个很短的时间后，电子再跃迁回低能级同时放出一个波长为长波长一半的光子（P=h/λ）。利用这个原理，便诞生了双光子激发技术。双光子显微镜使用长波长脉冲激光，通过物镜汇聚，由于双光子激发需要很高的光子密度，而物镜焦点处的光子密度是比较高的，所以只有在焦点处才能发生双光子激发，产生荧光，该点产生的荧光再穿过物镜，被光探头接收，从而达到逐点扫描的效果。激光双光子显微镜最大分辨率于双光子激发需要两个光子同时到达，因此只有在焦点附近的样品区域才会激发，从而实现三维成像和高分辨率。

随着技术的发展，双光子显微镜的性能不断优化。结合其特点，大致可以分为两个方面:深入和主动改进。为了使激发激光进入更深的层次，可以从器件优化和标本改造两个方面入手。关于器件的优化，我们可以把激光束做得更细，集中能量，让激光穿透得更深。对于样品，物质的吸收和散射是影响光传播的主要因素。为了解决这个问题，我们需要将样本透明化。一种方法是用某种物质浸泡标本，使其中的物质(主要是脂质)被破坏或溶解。另一种方法是通过电泳电解脂类，从而提高标本的“透明度”。

2020年，临研所、病理科和科研处邀请北京大学王爱民副教授做了题目为“新一代微型双光子显微成像系统介绍及其在临床医疗诊断”的学术报告。学术报告由临研所医学实验研究平台潘琳老师主持。王爱民，北京大学信息科学技术学院副教授，毕业于北京大学物理系，获学士、硕士学位，后于英国巴斯大学物理系获博士学位。该研究组研发的微型双光子显微镜，第1次在国际上获得了小鼠大脑神经元和神经突触清晰稳定的动态信号，该成果获得了2017年度“中国光学进展”和“中国科学进展”，并被NatureMethods评为2018年度“年度方法--无限制行为动物成像”。目前，该研究组正在研究新一代双光子显微成像技术在临床诊断中的应用，为未来即时病理、离体组织检测、术中诊断等提供新的影像手段和分析方法。优势来源于其双光子光源的非线性光学效应。

生物样品的三维观察是了解细胞功能的重要方法之一。目前已有的三维荧光成像技术有光学显微镜、点阵照明和激光扫描显微镜(如共焦显微镜和双光子显微镜)。其中，激光扫描显微镜利用转盘可以进行多焦点激光扫描，提高了时间分辨率，有利于减少活细胞成像中的光损伤。本文主要实现可见光双光子激发和多焦点激光扫描的结合，**终提高三维延迟扫描中的空间分辨率和成像对比度，这也是可见光双光子激发(v2PE)在超高分辨率显微镜中的应用。双光子显微镜厂家就找滔博生物。国外bruker双光子显微镜成像视野一般是多少

成像平台倒置双光子显微镜启用显微镜自带调焦设备。国内bruker双光子显微镜成像技术

和很多伟大的科学发明一样，双光子显微镜的出现也有一点偶然，但正是那瞬间的灵感为生物科学尤其是神经科学带来了一种**性的成像技术：双光子激发荧光显微镜。1990年初，当WinfriedDenk刚从康奈尔大学博士毕业准备前往瑞士读博后时，他看了一本关于激光扫描显微镜的书，从中了解到非线性光学效应——强光和物质的相互作用。当时，Denk有同事研究生物样品中的钙离子但苦于没有强大的紫外激光器和光学元件，于是他就想到如果使用双光子吸收就能够绕开紫外，换言之，与其通过一个紫外光子激发标记的钙离子，通过两个双倍波长的可见光光子也能激发相同的荧光。有了想法后马上实验。借了一套染料飞秒激光器，Denk联合他的导师WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六个小时就完成了实验搭建，采集数据则用了两到三天，于是一篇里程碑式的文章就此诞生了。国内bruker双光子显微镜成像技术