免疫荧光的原理和类型：免疫荧光利用荧光分子或荧光团在一定波长（分子的吸收光谱）下吸收光子的特性，经过短暂的间隔（发射光谱）后以较高的波长发射光子，并伴随能量损失。发射的荧光可通过显微镜观察到。荧光团可以通过可见光或紫外光激发。具有高光稳定性和荧光量子产率的荧光染料可在市场上购买，其激发较大值跨越从400到>700nm的波长范围。它们不会损伤活细胞，可安全用于生物制剂。在进行免疫荧光检测时，首先对细胞或组织进行固定和透化处理。进行免疫染色时，荧光团与目标抗原的抗体结合，然后使用成像显微镜观察荧光信号。根据使用的抗体和所需的信号扩增，免疫荧光可分为直接和间接两种类型。免疫荧光技术在生物学研究、医学诊断和药物开发等领域具有普遍应用。VEGFA免疫荧光

荧光色素：异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，较大吸收光波长为490495nm，较大发射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，结构式如下：有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用较普遍的荧光素。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精。性质稳定，可长期保存。结构式如下：较大吸收光波长为570nm，较大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。VEGFA免疫荧光免疫荧光技术可以用于研究内脏移植和免疫抑制。

细胞的固定及免疫荧光：吸去一抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向孔内滴加足够量适宜浓度的二抗，37℃，室温避光孵育1小时。注意二抗带有荧光素标记，因此操作过程尽量在暗处进行。吸去二抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向玻片上滴加DAPI，或者Hoechst复染细胞核，一般为蓝色荧光；避光孵育5-10min。使用PBS轻洗细胞3 次，每次 5 min，洗去多余的DAPI。取爬片时由于爬片与培养皿底结合较紧，张力较大，可将注射器针头针尖向背面做个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出即可。用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，注意将爬片反过来贴于多聚赖氨酸载玻片上，然后在荧光显微镜下观察并采集图像，注意选择抗体对应的激发光源。

细胞的固定及免疫荧光：1)吸除培养基，一般先加入PBS浸洗细胞 3 次，每次 5 min。2)向孔内加入4%多聚甲醛1ml，进行细胞固定，室温固定20分钟。3)吸去多聚甲醛，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。4)向孔内加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室温通透20min，目的是使细胞通透。5) 除去Triton X-100，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。6)用10%的与二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封闭2小时（选择的封闭液与后面操作过程中抗体稀释液一致）。封闭后不需要用PBS清洗。7)吸去封闭液，向每孔滴加足够量适宜浓度的一抗（一次使用抗体可以根据抗体说明书推荐浓度，后续实验可以摸索抗体的适宜浓度），4℃湿盒内孵育过夜。免疫荧光技术是一种利用荧光物质标记抗体来定位抗原的技术。

细胞免疫荧光：细胞种板与细胞爬片制备：1) 细胞密度在90%-95%左右，用预热胰酶消化细胞后重悬细胞于完全培养基中，充分吹打，使之成单细胞悬液，计数。2)取细胞培养12孔板，在每个孔放爬片的位置根据爬片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴几滴培养基，然后将爬片置于液滴上，压紧，使爬片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，防止加细胞悬液时爬片漂起，造成双层细胞贴片。根据自己的需要选择合适的细胞密度种入12孔板培养板内。3)24h或者48h后，根据细胞生长速度快慢，观察判断细胞密度，约90%时进行细胞免疫荧光。荧光抗体法是利用荧光标记的抗体来追踪或检查相应抗原的方法。BAX免疫荧光

荧光抗原法是利用已知的荧光标记物来追踪或检查相应抗体的方法。VEGFA免疫荧光

免疫荧光的制作：样品准备（贴壁细胞、悬浮细胞以及组织等）：对于贴壁细胞：先将洁净的盖玻片在70%乙醇中进行浸泡处理，然后用干净无菌的镊子放置到培养皿中，用无菌PBS洗去残留的乙醇。待细胞接近长成单层后取出盖玻片，操作小心，防止细胞脱片。对于悬浮细胞：有2种方法，①先在悬浮液中进行固定步骤，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。②先在悬浮液中进行固定和染色步骤，离心洗脱，然后用移液管移至盒式玻片进行后续染色步骤。对于冷冻切片：切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。对于石蜡切片：免疫荧光中石蜡切片较少，要先进行脱蜡和抗原修复处理。VEGFA免疫荧光